Quy trình nuôi cấy Bacillus cereus là một phương pháp được sử dụng để phân lập, định lượng và định danh vi khuẩn Bacillus cereus trong các mẫu thực phẩm, mẫu môi trường hoặc mẫu sinh học. Bacillus cereus là vi khuẩn Gram dương, có khả năng tạo bào tử, thường liên quan đến ngộ độc thực phẩm do sản xuất độc tố. Dưới đây là các bước cơ bản của quy trình nuôi cấy Bacillus cereus:

1. Chuẩn bị mẫu

• Lấy mẫu: Lấy mẫu thực phẩm, nước hoặc mẫu môi trường cần kiểm tra một cách vô trùng.
• Xử lý mẫu:
  • Nếu là mẫu thực phẩm rắn, nghiền nhỏ và pha loãng trong dung dịch pha loãng vô trùng (ví dụ: nước muối sinh lý 0.85% hoặc peptone water).
  • Nếu là mẫu lỏng, có thể sử dụng trực tiếp hoặc pha loãng tùy thuộc vào mức độ nhiễm khuẩn dự đoán.

2. Pha loãng mẫu

• Thực hiện các bước pha loãng liên tiếp (thường là 1:10) để giảm nồng độ vi khuẩn trong mẫu.
• Ví dụ: 1 ml mẫu pha loãng vào 9 ml dung dịch pha loãng, tạo ra độ pha loãng 10^-1. Lặp lại để tạo ra các độ pha loãng cao hơn (10^-2, 10^-3, …).

3. Chọn môi trường nuôi cấy

• Môi trường chọn lọc:
  • Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar (MYP): Môi trường chọn lọc cho Bacillus cereus. Vi khuẩn Bacillus cereus không lên men mannitol nên tạo khuẩn lạc màu hồng, xung quanh có vòng kết tủa do phản ứng với lecithinase.
  • Polymyxin Pyruvate Egg Yolk Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA): Môi trường chọn lọc khác cho Bacillus cereus, khuẩn lạc có màu xanh lam.
• Môi trường không chọn lọc:
  • Tryptic Soy Agar (TSA) hoặc Plate Count Agar (PCA): Dùng để nuôi cấy tổng vi khuẩn hiếu khí.

4. Cấy mẫu

• Cấy trải: Lấy một lượng nhỏ mẫu đã pha loãng (thường là 0.1 ml hoặc 1 ml) và cấy lên bề mặt môi trường thạch.
• Cấy sâu: Nếu sử dụng phương pháp đổ đĩa, trộn mẫu với thạch đã làm nguội (khoảng 45°C) rồi đổ vào đĩa petri.
• Ủ ấm: Đặt các đĩa petri vào tủ ấm ở nhiệt độ 30-35°C trong 24-48 giờ.

5. Quan sát và phân lập khuẩn lạc

• Sau thời gian ủ ấm, quan sát các khuẩn lạc mọc trên đĩa:
  • Trên môi trường MYP, Bacillus cereus tạo khuẩn lạc màu hồng, không lên men mannitol, và có vòng kết tủa xung quanh do phản ứng lecithinase.
  • Trên môi trường PEMBA, khuẩn lạc có màu xanh lam.
• Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ và cấy chuyển sang môi trường mới để phân lập thuần khiết.

6. Định danh vi khuẩn

• Nhuộm Gram: Bacillus cereus là vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng tạo bào tử.
• Kiểm tra sinh hóa: Thực hiện các phản ứng sinh hóa để xác nhận Bacillus cereus, bao gồm:
  • Catalase test: Bacillus cereus dương tính.
  • Oxidase test: Bacillus cereus âm tính.
  • Khả năng lên men đường: Bacillus cereus không lên men mannitol.
  • Phản ứng lecithinase: Dương tính trên môi trường có lòng đỏ trứng.
• Phương pháp phân tử: Nếu cần độ chính xác cao, có thể sử dụng PCR hoặc giải trình tự gen để xác định loài cụ thể.

7. Đếm khuẩn lạc và tính toán kết quả

• Đếm số lượng khuẩn lạc trên các đĩa có số lượng khuẩn lạc trong khoảng 30-300.
• Tính toán số lượng vi khuẩn Bacillus cereus trong mẫu ban đầu dựa trên số lượng khuẩn lạc và độ pha loãng.
• Kết quả được báo cáo dưới dạng CFU/g hoặc CFU/ml.

8. Báo cáo và phân tích

• Báo cáo kết quả số lượng Bacillus cereus trong mẫu.
• Đánh giá mức độ nhiễm khuẩn và so sánh với tiêu chuẩn an toàn thực phẩm.